食品防腐剂苯甲酸钠的致突变作用研究 材 料 汇 编
课 题 编 号
结 题 形 式
会议结题
课 题 研 究 单 位
县第一中学
课题研究负责人
A
课 题 研 究 成 员
B
C
制作时间：2018年 9 月 7 日
1
目
录
市教育教学微型课题申请·评审表 ............................. 2 立项证书 .................................................. 11 实验过程与结果分析 ........................................ 12 市基础教育教学研究微型课题结题申请书 ...................... 19 《食品防腐剂苯甲酸钠的致突变作用研究》结题报告 ............. 20 论文集 .................................................... 30 附录材料 ................................... 错误! ! 未定义书签。
市教育教学微型课题研究成果鉴定书 .......................... 71
2
市教育教学微型课题申请·评审表 负责人 A 工作 单位 县第一中学 联系电话
主要 参加者 姓
名 职
称 学历 工 作 单 位 A 中学二级 本科 县第一中学 B 中学一级 本科 县第一中学 C 中学二级 硕士 县第一中学 课 题 名 称 食品防腐剂苯甲酸钠的致突变作用研究 选 题 缘 由 随着社会的发展和科技的进步，人们对于自身健康和环境安全越来越关注，尤其是食品安全。食品防腐剂苯甲酸钠（化学式 C 6 H 5 CO 2 Na）是常用的防腐剂之一。苯甲酸钠进入人体后，可与甘氨酸作用生成马尿酸，从尿中排出，剩余部分与葡萄糖化合而解毒。该解毒作用是在肝脏內进行的，肝功能不好的人不宜使用。
经研究苯甲酸钠在人体肠道的酸环境下可转化为毒性较强的苯甲酸。食入少量苯甲酸则引起流口水、腹泻、肚痛、心跳快等症狀。小鼠摄入苯甲酸及其钠盐，会导致体重下降、腹泻、初血、瘫痪甚至死亡。
本选题拟从测定苯甲酸钠对小鼠的半数致死量（LD 50 ）入手，设定不同的浓度梯度，探讨不同浓度的苯甲酸钠对小鼠骨髓嗜多染红细胞和小鼠精子的损伤，确定苯甲酸钠的致突变浓度，为日常安全的利用苯甲酸钠提供理论依据。
研 究 设 想 该项目通过对小鼠进行腹腔注射，主要研究苯甲酸钠的致突变作用，从体细胞、生殖细胞 2个层次上，分 2个阶段进行研究。
1、苯甲酸钠 LD 50 值的测定：
2、不同浓度苯甲酸钠的致突变作用：主要通过 2个层次进行研究：
（1）小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核试验：
骨髓细胞经致突变物作用，其染色体可发生畸变以致断裂。其断裂的碎片在分裂间期留在子细胞内形成一个或几各圆形或椭圆形结构的小块物质，称为微核。利用不同浓度的苯甲酸钠（根据 LD 50 值设定）诱导微核，与未注射药品小鼠对照相比，借助软件分析数据，得出结论。
（2）小鼠精子畸形试验：
精子畸形试验是检测环境因子对精子生成、发育的影响, 也是检测雄性生殖细胞遗传毒性的重要试验之一。利用不同浓度的苯甲酸钠（根据 LD 50 值设定）诱导精子畸变，计算畸形率，与未注射药品的小鼠进行对照相比，利用软件分析数据，得出结论。
综合上述 2 方面的试验，确定苯甲酸钠的致突变浓度，为日常安全的利用苯甲酸钠提供理论依据。
3 注：1.课题组成员不得超过三人（含课题负责人），且当年只能承担参与一项课题研究； 2. 正文宋体小 4 号，篇幅控制在 A4 纸 2 页的范围内。
单位 审查 意见 （单位盖章）
年
月
日 县（区）
意
见
（单位盖章）
年
月
日 市级 审查 意见
（单位盖章）
年
月
日
4 登记号
《课题设计论证》活页 课题名称：
食品 防腐 剂 苯甲酸钠的 致突变作用研究
注意事项：本活页中一律不得出现申报人、主要参与者及有关单位等有效信息，否则按放弃申报处理 课题设计论证
· 本课题国内外研究现状述评、选题意义和研究价值； ·本课题的研究目标、研究内容、研究假设和创新之处； ·本课题的研究思路、研究方法、技术路线和实施步骤。
（限 3000 字内）
一、 项目实施的意义 和价值及国内外研究现状 随着社会的发展和科技的进步,人们对于自身健康和环境安全越来越关注，尤其是食品安全。食品防腐剂苯甲酸钠（化学式：C 6 H 5 CO 2 Na）是常用的防腐剂之一。有防止变质发酸、延长保质期的效果，在世界各国均被广泛使用。苯甲酸钠进入人体后，可与甘氨酸作用生成马尿酸，从尿中排出，剩余部分与葡萄糖化合而解毒。该解毒作用是在肝脏內进行的，肝功能不好的人不宜使用。
经研究苯甲酸钠在人体肠道的酸环境下可转化为毒性较强的苯甲酸。食入少量苯甲酸则引起流口水、腹泻、肚痛、心跳快等症狀。小鼠摄入苯甲酸及其钠盐，会导致体重下降、腹泻、初血、瘫痪甚至死亡。另外苯甲酸钠还可以用于医药工业的杀菌剂、染料工业的媒染剂、塑料工业的增塑剂等领域。
2012 年牟悦等以分子毒理学为理论基础,通过多种光谱学技术和分子对
5 接方法,在体外模拟生理环境,研究食品添加剂苯甲酸钠进入人体后对在运输、消化和排出体外过程中接触较多的的四种重要蛋白质——血清白蛋白、血红蛋白、胰蛋白酶、过氧化氢酶——的毒性作用机理,为系统评价苯甲酸钠的生理毒性提供参考,也为预防和治疗相关疾病提供新的思路和方法。2010 年王思文等对苯甲酸钠的防腐机理和毒性机理研究,并介绍了苯甲酸钠及其替代物的利用现状。2016 年陈玲等研究苯甲酸钠对小鼠体重的影响说明苯甲酸钠通过肠道菌群抑制作用,促进肥胖发生。
本选题拟从测定苯甲酸钠对小鼠的半数致死量（LD 50 ）入手，设定不同的浓度梯度，探讨不同浓度的苯甲酸钠对小鼠骨髓嗜多染红细胞和小鼠精子的损伤，确定苯甲酸钠的致突变浓度，为日常安全的利用苯甲酸钠提供理论依据。
二、 项目研究 目标 通过探讨苯甲酸钠对小鼠体细胞和生殖细胞的致突变浓度，为日常安全的利用苯甲酸钠提供理论依据。
四 、 研究内容 和 方法 该项目通过对小鼠进行腹腔注射，主要研究苯甲酸钠的致突变作用，从体细胞、生殖细胞 2 个层次上，分 2 个阶段进行研究。
四、研究思路 1、苯甲酸钠 LD 50 值的测定：得到苯甲酸钠的 Dm 值（使动物 100% 死亡的剂量）和 Dn 值（使动物 0% 死亡的剂量），计算 LD 50 值。
2、不同浓度苯甲酸钠的致突变作用：主要通过 2 个层次进行研究：
（1）小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核试验：
6 骨髓细胞经致突变物作用，其染色体可发生畸变以致断裂。其断裂的碎片在分裂间期留在子细胞内形成一个或几各圆形或椭圆形结构的小块物质，由于它比普通细胞核小，故称为微核。由于微核是染色体畸变断裂所造成的结果，所以微核检出率增高可反映染色体的畸变情况。利用不同浓度的苯甲酸钠（根据 LD 50 值设定）诱导微核，与未注射药品的小鼠对照相比，通过软件分析，得出结论。
（2）小鼠精子畸形试验：
精子畸形试验是检测环境因子对精子生成、发育的影响, 也是检测雄性生殖细胞遗传毒性的重要试验之一。小鼠精子畸形受基因控制,具有高度遗传性,许多常染色体及 X、Y 性染色体基因直接或间接地决定精子形态。利用不同浓度的苯甲酸钠（根据 LD 50 值设定）诱导精子畸变，计算畸形率，与未注射药品的小鼠进行对照相比，利用软件进行分析，得出结论。
综合上述 2 方面的试验得出结论。
五、技术路线
7
六、研究实施步骤：
1. 碳酸氢胺 LD 50 值的测定：
（1）设定 5 个浓度梯度，给小鼠进行腹腔注射，每组 5 只，观察记录小鼠症状和死亡情况，得到苯甲酸钠的 Dm 和 Dn 值。
（2）根据 Dm 和 Dn 值计算 LD 50 值。
2. 苯甲酸钠的致突变作用
8 （1）小鼠骨髓多染红细胞微核试验：分组：设定 3 个苯甲酸钠浓度（1/2LD 50 值作为最高剂量、实际应用剂量作为最低剂量、中间剂量）作为试验组，用相同生长环境下未注射药品的小鼠进行对照。每组 10 只（雌雄各半）腹腔注射，1 天给药 1 次，连续给药 3-6 天，最后给药 24 小时后采样。采用骨髓直接涂片法，做成玻片。每只动物至少观察计数 1000 个嗜多染红细胞，计数微核出现的频率，微核率以千分率表示。计算各组的平均值，进行显著性程度分析，得出结论。
（2）小鼠精子畸形试验：设定 3 个苯甲酸钠浓度（1/2LD 50 值作为最高剂量、实际应用剂量作为最低剂量、中间剂量）作为试验组，用相同生长环境下未注射药品的小鼠进行对照。每组 10 只，腹腔注射，1 天给药 1 次，连续给药 3-6 天，最后给药 24 小时后采样。取小鼠附睾制片，每只小鼠计数200 个精子，统计畸形数。计算各组的平均值，进行显著性程度分析，得出结论。
七、研究假设和创新之处 长期食入苯甲酸会使老鼠食欲差、成长緩慢，假设实验小鼠身体健康状况都相同的条件下，苯甲酸钠具有一定的致突变作用，该实验通过分析苯甲酸钠对小鼠体细胞和生殖细胞的畸形率，确定苯甲酸钠的致突变浓度，方法简单，成本低，可行性高，可以为食品中添加苯甲酸钠的量提供理论数据，为人类食品安全尽微薄之力。
9 完成课题的可行性分析 · 已取得的相关研究成果及其社会评价（引用、转载、获奖及被采纳情况），主要参考文献（相关研究成果、主要参考文献两类限填 20 项）； ·主要参加者的学术背景和人员结构（职务、专业、年龄）； ·完成课题的保障条件（如研究资料、实验仪器设备、研究经费、研究时间及所在单位条件等）。
（限 1500 字内，本页不够可加页。注意事项和活页相同）
一、已取得相关研究成果：
课题负责人和成员都有多次参加课题并公开发表论文，获得多项教学成果奖励。
二、主要参加者的学术背景和研究经验、组成结构 负责人 1：A，女，中教二级，延安大学本科，生物教育，2017.08 参加工作，多次获得教学成果奖，并发表有关教学方面的论文，深受师生的欢迎。
成员 1：B 男， 1986 年师范毕业，同年 8 月参加工作，先后在崔家湾中学，教师进修学校工作，2017年 10 月正式调入县第一中学 任生物教师并获得多项奖励。
成员 2
C，女，中教二级，西北农林科技大学 硕士
化学生物学专业，2017年 8 月到第一中学担任高中生物教师。多次从事本课题相关研究内容，具有熟练地实验操作和数据分析技能。
三、课题的保障条件
此项目采用的 2 种试验技术是检测致突变性的常见方法，技术成熟可
10 靠。项目成员具有一定的试验经验和研究能力。该实验成本较低，所用仪器简单。该校对科研项目极为重视，对已有相应的规章制度，并对实验室环境和设备有了较大的投入，已满足本实验所用的条件和仪器。完全能保证该实验的顺利开展。
11 立项证书
12 实验过程与结果分析 一、 实验过程 1 ．材料与 器材 1.1 材料：昆明种小鼠，体重 20-25g
1.2 试剂：苯甲酸钠(天津市天力化学试剂有限公司，分析纯) 、蒸馏水。
1.3 器材：烧杯、玻璃棒、电子秤、量筒、移液管、一次性注射器（1ml）、手套、鼠笼等。
2. 实验方法 2.1 苯甲酸钠半数致死量（LD 50 ）
的测定 （1）
先用 10 倍稀释的药物浓度系列，用少量小鼠（每组 2-3 只）找出大致死亡范围。
(2) 取 20只小鼠，按性别分类后，根据体重随机分为 5 组，每组 4只，实验前禁食 24 小时，配制系列浓度的苯甲酸钠，以各浓度的0.2mL/10g 给每只小鼠一次性腹腔注射，连续观察 7 天，记录动物的死亡情况。
(3)通过实验，寻找出0%（Dn）和100%（Dm）的致死剂量。
（4）根据测定的Dm和Dn值，剂量比值根据公式设为0.907,设定4个浓度梯度，其从高到低依次为：
495mg/kg:
30.94mg/ml=0.31g+10ml 蒸馏水
13 449mg/kg: 28.06mg/ml=0.28+10ml 蒸馏水 407mg/kg: 25.43mg/ml=0.254+10ml 蒸馏水 369mg/kg:
23.06mg/ml=0.23+10ml 蒸馏水 （5）腹腔注射：
将 40 只小鼠随机分成 4 组，每组 10 只，雌雄各半，使其形成一个均匀的整体，以减少因个体差异而造成的误差。试验前禁食处理24h，禁食期间均正常给水。按上述设定所配的 4 个浓度梯度，分别给小鼠进行一次性腹腔注射，每个浓度注射 10 只小鼠，注射量 0.4 ml/只。
注射时应在常温、常压下缓慢进行、防止注射器有气泡、注意注射的位置，注射后给以进食。
（6）观察记录：
注射后，通过深入细致地观察小鼠的中毒症状及其发生、发展的过程与规律，特别要注意小鼠中毒症状及、死亡所需时间的差异等死亡情况，连续观察 7 天，一般给药后持续观察 30 分钟，第 1- 4 小时再观察 1 次，以后每天观察 1 次， ，记录不同浓度梯度下小鼠每天的死亡数和时间，及出现的异常现象。
2.2 苯甲酸钠 的致突变 作用 2.2.1 腹腔注射 将 40 只小鼠分为 4 组，每组 10 只，即三个实验组和一个对照组。3 个试验组分别按苯甲酸钠 100、172.5、245 mg/kg 给药，用相同生长环境下未注射药品（注射蒸馏水）的小鼠作为对照组，采用腹腔
14 注射连续染毒 4 d，每日一次，每次 0.3 mL，在最后一次染毒 24 h 后采样。
2.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验
将小鼠脱颈椎处死，迅速取两侧股骨，用生理盐水冲洗骨髓细胞，离心弃上清液，留下沉淀并滴加 2～3 滴生理盐水，用吸管轻轻混匀。涂片，晾干。甲醇中固定 10 min，干燥。10% Giemsa 染色 10 min，然后用蒸馏水冲洗，晾干。
2.2.3 小鼠精子试验
将小鼠脱颈椎处死，剖开腹腔，暴露睾丸，分离两侧附睾，置于盛有 1 mL 生理盐水中剪碎，再加 1 mL 稀释，轻轻吹打后，静止 3 min，再用 4 层擦镜纸过滤，吸取滤液 1 滴于玻片上，均匀涂片。待干燥后，放入甲醇与冰乙酸(3:1)液中固定 5 min，晒干。2%伊红染色 1 h，然后用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。
2.2.4 计算与统计 每只小鼠观察 2000 个骨髓嗜多染红细胞，并计算微核率；微核率(MCN%)=含微核的嗜多染红细胞数/嗜多染红细胞数×1000。
每...
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