篇一：过氧化氢酶动力学常数测定
实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定
姓 名：
赵家熙 指导教师：
谭志文 实验室：
6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩：
第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据
1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：
（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L
（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据
消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65
实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30
（二）结果计算
1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）
1.7
2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）
(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=
酶活(mgH2O2/g·min)=0.218
（A-B）=0.8 VT=20.25FW=5.032V1=2.5mlt=10min
二、动力学常数的测定 （一）原始数据
（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度
V0
（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图）
1/s 1/v
200 111.1
149.2 80.6
121.9 79.3
80 45.1
40 21.2
（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）
Km11?? vv[S]v如（三）中图
maxmax
y=0.5572x+1.5829 x=0时 y=1/Vmax
y=0时 x=-1/Km
Km=0.35 Vmax=0.63
第四部分：课后研讨题
1.总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?
1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。
2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。
3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2
4.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？
终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。
5.米氏方程中的Km有何实际应用？
米氏常数是酶促反应速度n为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。可用于判断反应级数；
判断是否为不同种酶；
判断酶的最适底物；
确定酶活性测试时所需底物的浓度。
6.在什么条件下，酶的Km可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？
当ν=Vmax/2时，Km=[S]。Km值是酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
Km值对某一特定酶来说是个常数。一半根据酶的Km值来判断这些酶是否是完全相同的酶，或是催化同一反应的一类酶。
Km值越大，酶与底物亲和力越小；
Km值越小，酶与底物亲和力越大。
7.测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行？
进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，说明酶的反应速度下降。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所致。
8.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使
反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。请你查阅资料一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验。
实验概要
本实验用紫外吸收法测定了过氧化氢酶的活性。
主要试剂
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
主要设备
紫外分光光度计；
离心机；
研钵；
250ml容量瓶1个；
0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；
10ml试管3支；
恒温水浴。
实验步骤
1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2. 测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表顺序加入试剂。
表 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
篇二：测定过氧化氢酶Km
实验一 过氧化氢酶Km的测定
【原理】
本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：
?????2H2O+O2↑ 2H2O2?过氧化氢酶
H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。
2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4 ??? 2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O
求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。作图求出过氧化氢酶的米氏常数。
【试剂】
1．0.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100～105℃烘12h。冷却后，
准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。
2．约0.02ml KMnO4储存液 称取KMnO4 3.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。
3．0.004mol/L KMnO4应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4 ml，于70℃水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。
4．约0.08mol/L H2O2液 取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO4标定之，稀释至所需浓度。
5．0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。
【操作步骤】
l．血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。
2．H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。
3．反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。
加入物(ml) H2O2(约0.08mol/L)
蒸馏水
1 0.50 3.0
2 1.00 2.50
3 1.50 2.00
4 2.00 1.50
5 2.50 1.00
将各瓶置37℃水浴预热5min，依次加入1：1000稀释血液每瓶0.5ml，边加
边摇，继续保温准5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。
最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。
【计算】
1．反应瓶中H2O2浓度(mol/L)?
H2O2 mol浓度?加入H2O2ml数
4
?
H2O2 mmol数
4
（式中：4为反应液量4ml） 2．反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。
反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余的H2O2 mmol数
即：H2O2 mol浓度×加入的毫升数－KMnO4 0.004 mol/L×消耗的KMnO4毫升数× 5/2（式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数） 3．求Km值：
下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。
己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.08mol/L，列表计算如下：
计算程序
①加人H2O2数
②加人H2O2mmol=①×0.08 ③底物浓度［S］=②÷4 ④酶作用后，KMnO4滴定ml
1 0.50 0.04 0.01 1.35
2 1.00 0.08 0.02 3.70 0.037 0.043
3 1.50 0.12 0.03 6.40 0.064 0.056
4 2.00 0.16 0.04 9.80 0.098 0.062
5 2.50 0.20 0.05 13.20 0.132 0.068
⑤剩余H2O2mmol=④×0.004×5/2 0.0135 ⑥反应速度V=②一⑤
0.0265
⑦[S]/V=③÷⑥ 0.377 0.465 0.536 0.645 0.735
按前述方法作图求得Km＝0.032mol/L。
【思考题】
l．Km值的意义是什么？
2．测酶Km值的实验中，需要特别注意哪些操作？
篇三：酶工程实验(2015.3)
实验一 过氧化氢酶米氏常数的测定
一、 目的
了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、 实验原理
H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性
环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km
三、 实验器材
1. 锥形瓶100～150ml（×6）。
2. 吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3. 温度计（0～100℃）。
4. 微量滴定管5ml（×1）。
5. 容量瓶1000ml（×1）。
四、 实验试剂
1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）
取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4 ：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4 ：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml
浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻
度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4
五、操作
取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：
表一 过氧化氢酶米氏常数的测定
先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml 25%硫酸终止反应，充分混匀。用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。
六、计算
分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。
[S]=c1V1/10
式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；
c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；
V1：H2O2体积（ml）；
10：反应的总体积（ml）；
υ：反应速度（m mol/min）；
c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；
V2：KMnO4体积（ml）；
以1/υ对1/[S]作图求出Km。
实验二 酶促反应中初速度时间范围测定
一、实验目的
1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；
2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理
酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材 1.试剂
（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取） （2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）
取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间。
（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯
精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。
（4）0.3mol/LNaOH溶液 2．器材
恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。
四、操作步骤
1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备
称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。
2.酶促反应
取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；
另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值。
3.数据处理
以反应时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量
五、实验
绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
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